本文標題："大腸桿菌中表達和純化蛋白質(zhì)載體的特征技術(shù)"
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大腸桿菌中表達和純化蛋白質(zhì)載體的特征技術(shù)
在原核生物特別是大腸桿菌中表達真核生物的目的基因。純化出的
蛋白質(zhì)表達產(chǎn)物是研究蛋白質(zhì)結構與功能，蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)、蛋白
質(zhì)一核酸間的相互作用，制備抗體及突變研究等的基礎，也是基因
克隆的目的所在。在大腸桿菌中表達和純化蛋白質(zhì)操作相對簡(jiǎn)便，
表達效率很高，而且表達量容易控制，因此應用最為廣泛。目前蛋
白質(zhì)表達的方法大多是將編碼所需產(chǎn)物的基因插入表達型質(zhì)粒，然
后將該載體導人細胞。典型的表達載體除具有一般克隆載體的特征
外還包含指導相應mRNA大量合成的啟動(dòng)子、允許其在宿主體內自主
復制的序列和能增強mRNA翻譯效率的序列。
1)原核表達載體特點(diǎn)
根據不同需要，人們構建了多種原核表達載體，即在相應的受
體細胞中能表達外源基因的載體，這些原核表達載體通常有如下特
點(diǎn)：①有一個(gè)強的原核啟動(dòng)子及其兩側的調控序列；②應有SD序列
，而SD序列與起始密碼子AUG之間要有合適的距離；③在克隆基因
與啟動(dòng)子之間應有正確的可讀框；④外源基因下游應加入不依賴(lài)p
因子的轉錄終止區。
2)提高外源基因表達水平的措施
只要考慮到表達載體、外源基因的性質(zhì)、原核細胞的啟動(dòng)子、
可讀框及宿主調控系統等條件，一般都可使外源基因在原核細胞中
有所表達。但如何使外源基因在原核細胞中獲得高效表達仍是需要
努力探索的目標之一?，F在可通過(guò)以下方法提高基因的表達水平：
①調整SD序列與AUG之間的距離；②用點(diǎn)突變的方法改變某些堿基
，以消除mRNA二級結構，提高翻譯的完整性；③在真核基因下游插
入重復性回文序列或其他具有反向重復序列的DNA片段，防止限制
性外切核酸酶的攻擊，從而起到穩定mR—NA，提高表達水平的作用
；④通過(guò)誘導表達或誘導復制，減輕細胞代謝負荷，提高外源基因
表達效率；⑤在外源蛋白N端加一段原核短肽或采用某種蛋白酶突
變菌株，保護表達蛋白不被降解。
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