目的

生物學(xué)的研究過(guò)程通常需經(jīng)三個(gè)階段：首先由基礎的細胞層次開(kāi)始，接著(zhù)進(jìn)入動(dòng)物模式，最后再進(jìn)行ren試驗研究；

所以細胞培養技術(shù)是現代生物技術(shù)研究最基本的實(shí)驗技術(shù)之一。本實(shí)驗是使用F12 培養液來(lái)培養人類(lèi)橫紋肌肉瘤RD 細胞株，

借著(zhù)實(shí)驗的操作過(guò)程可使操作者熟悉無(wú)菌操作與細胞繼代培養的相關(guān)技術(shù)。

 

 

原理

本章節所介紹之細胞培養相關(guān)技術(shù)有三：

細胞繼代培養技術(shù)：由于細胞貼附在培養皿上需要鈣離子的參與，所以可利用具有螯合鈣離子特性的EDTA ，配合胰蛋白酶(trypsin) 的作用，將細胞自培養皿上分離出來(lái)。

細胞數及細胞存活率計數技術(shù)：死細胞由于細胞膜破損，所以細胞染劑如：錐藍(trypan blue) 可自由進(jìn)出細胞膜，因而將死細胞的細胞核染上顏色，但活細胞則否，所以可配合血球細胞計數盤(pán)(hemocytometer) ，于相位差顯微鏡下計算出活細胞數量并估算出細胞存活率。

 

細胞保存及解凍技術(shù)：利用抗凍劑DMSO 可以減少細胞于冷凍過(guò)程中受到冰晶的傷害，因此在細胞溶液中加入適當比例的DMSO ，則可于液態(tài)氮中長(cháng)期保存細胞株

 

 

材料與器具

實(shí)驗儀器及用具

實(shí)驗材料

 

實(shí)驗儀器及用具

低溫保存管(cryotube) （細胞用）及低溫保存盒

細胞培養皿(petri dish)

微量吸管及電動(dòng)吸管(pipette and pipette aid)

血球細胞計數盤(pán)(hemocytometer)

相位差顯微鏡

37℃ 二氧化碳細胞培養箱(CO2 incubator)

恒溫水浴槽(water bath)

無(wú)菌操作臺(laminal flow)

桌上型離心機

液態(tài)氮桶

 

實(shí)驗材料

F12 培養液

二次蒸餾水(ddH2O)

胎牛血清(fetal calf serum ；FBS)

重碳酸氫鈉(sodium bicarbonate)

TE(trypsin-EDTA) 溶液

磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffer-saline ；PBS)

抗生素（penicillin 100,000 IU/L 及streptomycin 100 mg/L ）

細胞染劑(trypan blue solution 0.4%, w/v)

 

抗凍劑(dimethyl sulfoxide ；DMSO)

75% 酒精